吴玉清Yuqing Wu

(教授)

 博士生导师  硕士生导师
学位:博士学位
曾获荣誉:2006年教育部新世纪优秀人才支持计划。
性别:女
毕业院校:吉林大学
学历:博士研究生毕业
所在单位:超分子结构与材料国家重点实验室
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科学研究

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研究领域

    I 病毒蛋白的体外组装调控和机理研究:


        人乳头瘤病毒(HPVs)是一种无包膜的双链DNA肿瘤病毒,其壳体是由主要衣壳蛋白L1和次要衣壳蛋白L2组成的二十面体。高危型HPV是引起女性子宫颈癌、鼻咽癌和头颈癌的主要致病基因。虽然现已有预防型HPV疫苗上市,但它们在使用中仍面临如成本高、稳定性差、预防型别专一性等诸多的局限;而且,目前临床上还没有用于治疗HPV相关疾病的专门、有效的药方。研发成本低、稳定性好或具有广谱性的新型抗HPV制剂迫在眉睫。病毒颗粒的组装-解组装过程是其生命周期中的关键步骤,以此为调控靶点是开发新型抗病毒药物的可行方案之一。基于上述研究背景,我们重点开展了以下几个方面的研究:



    (1)HPV L1单体到五聚体组装动力学调控平台的构建:

    为增加HPV L1E. coli中的可溶性表达量和便于蛋白纯化, GST是常用的L1标签之一。生物学家常将纯化后的GST-L1中的标签在凝胶色谱上直接切掉,洗脱后得到组装完好的五聚体以及未正确折叠、本身无法再形成五聚体的L1单体; 然而,如果不经柱上酶切而将纯化得到的GST-L1从纯化柱上直接洗脱,由于GST的空间位阻效应此时的L1只能以单体形式存在。但是,如果此时再将GST酶切以后那些折叠正确的L1依然能很好地组装成五聚体,且其组装速率取决于酶切速率;而且还受组装环境的影响。因此,基于这个改进,我们建立了体外监控L1五聚体形成的动力学研究平台(Chem. Commun., 2013, 49, 8546)。进一步,基于阴离子(磺酸基、脯氨酸等)修饰的芳烃类大环化合物对单体界面上特殊位点赖氨酸(Lys)和精氨酸(Arg)的选择性识别我们有效地调控了五聚体的组装(Chem. Commun., 2014, 50, 3201;ChemistrySelect, 2016, 1, 6243)。通过终止病毒生命周期中的一个关键步骤,为开发新型抗HPV小分子抑制剂开辟了新途径。该研究成果得到ChemistryWord的亮点评述。

                                       

    (2) 影响HPV五聚体形成的关键单个位点(Hot-spot):

        在研究中我们发现,位于HPV 16L1蛋白C-末端的螺旋-5 (h5)466位的精氨酸被偶然突变成组氨酸(R466H)后,五聚体便无法再形成。 将这一突发现象在另一高危型别—HPV 18L1蛋白对应的467位点确认后,我们进一步将16L1中该位点临近的其它五个位点也分别进行了丙氨酸突变(alanine-screening)。结果发现:氨基酸残基464LGR466中任何一个单个位点的突变都能完全破坏五聚体的形成;L469A虽不能破环五聚体的组装,但它有效地提高了蛋白质在上清液中的可溶性表达(Mol. BioSyst., 2014, 10, 724)。鉴于LGR序列在所有PVs型别中的绝对保守性,若以此为靶点来设计药物抑制剂必将增强抗PVs的广普性。

    (3)HPV 16和HPV 18衣壳蛋白的杂合共组装:

    基于分子生物学技术、通过互换关键结构域¾a-螺旋4 (helix 4)及其连接肽链段,我们成功地实现了HPV16/18类病毒粒子(VLPs)的可控杂合组装;并通过荧光共振能量转移(FRET)以及免疫共沉淀 (Co-IP) 技术对杂合组装体进行了确认和表征。利用经我们改进后的磁珠Co-IP技术,定量确认出当两者五聚体以1:1摩尔比进行混合时杂合组装体中16 L118 L1的比例为3:5;而且该比例随组装条件的变化而改变。此外,该杂合组装体与常规VLPs具有相似的热稳定性,展示其具有很好的应用潜力。该研究成功地调控了病毒生命周期中的关键步骤,它不但加深了人们对病毒结构蛋白的理解、还将为制备更稳定、廉价和广谱的多价抗病毒疫苗提供新的思路。(ACS Appl. Mater. Interfaces, 2016, 8, 34244)

                                       


    II 多金属氧簇(POMs)与病毒衣壳蛋白的杂合组装调控及组装体生物学应用:

    (1)   多金属氧簇与富含碱性残基HPV肽链段的组装调控及应用研究:

        表面带有负电荷的杂多酸对碱性氨基酸(如精氨酸、赖氨酸)具有强识别相互作用,并引起多酸发光效应的大幅度增强(ChemPlusChem 2014, 79, 1208)。在HPV的衣壳蛋白L1L2的序列中,均包含有多个富含碱性残基的肽链段,它们分别肩负核定位(NLS)信号肽和病毒入侵细胞的功能。当它们与表面含有负电荷的杂多酸相遇时,以静电相互作用为主、氢键和疏水相互作用为辅的多重分子间弱相互作用力导致它们可以杂合组装成球形、片层或更致密的大球等多重超分子组装体。在研究含铕杂多酸与生物大分子相互作用的过程中,我们发现人乳头瘤病毒(HPV)衣壳蛋白L1L2中富含碱性氨基酸残基(精氨酸、赖氨酸和组氨酸)的肽链段能够通过静电和氢键相互作用与表面含有9个负电荷的铕多酸(EuW10)快速自组装成粒径在~250 nm的均匀纳米微球、并同时诱导铕的发光性能的大幅度增强(J. Phys. Chem. C 2015, 119, 832)。然而进一步的研究表明:当使用表面含有13个负电荷的另一个含铕和钼的杂多酸(EusSiMoW13)与具有相同氨基酸序列的小肽相互作用时,却表现出一个明显的两步自组装过程:当小肽比例较低时两者组装成有序的条带状结构;而随着小肽比例的增加它们再逐渐形成纳米微球,并同时诱导更大幅度的铕的发光增强(Chem.-Eur. J. 2015, 21, 9028)。这些结果为进一步研究杂多酸与蛋白质分子的相互作用及本质揭示提供了依据, 也为进一步拓展无机多酸在HPV相关领域的应用奠定了基础。

                       

    (2)对不同型别HPV的区分和对全长L1蛋白的检测:

    宫颈癌是全球女性的第二大杀手,无论是对生物靶标分子的确定或是相应检测技术的研发对其早期诊断都尤为重要。多金属氧簇与富含碱性残基的多肽的共组装可有效地促进其发光效应的增强,使其在多个生物学领域都展示了很好的应用(Soft Matter, 2016, 12, 8464)。基于人乳头瘤病毒(HPV)衣壳蛋白L1L2中所富含的碱性氨基酸和肽链段,我们成功将含铕多金属氧簇应用到对HPV衣壳蛋白L1的体外检测中,该方法不但高效而且廉价、易于操作 (RSC Adv., 2016, 6, 28612)。进一步,基于肽链段中碱性氨基酸个数和序列的不同、通过精确调控多金属氧簇表面的负电荷数,我们将表面带有9个负电荷的含铕多金属氧簇(EuW10)有效地应用于四种HPV型别的分类研究中 Dalton Trans., 2016, 45, 15457


    (3).对HPV入侵细胞时潜在受体分子的筛选:

    进一步,我们将所构筑了POMs-碱性肽组装体系应用到HPV入侵细胞时潜在表面受体分子的筛选中。通过对多酸表面电荷和衣壳蛋白L1L2中小肽序列的精确选取,基于细胞表面不同糖胺聚糖(GAGs)分子对POMs-小肽组装体系中小肽的竞争性识别和相互相互作用,实现了对潜在受体分子的初步筛选;同时,还通过该竞争性三元体系反向证明了在HPV在入侵细胞时可能起关键作用的一些肽链段。该过程的本质机理由荧光滴定、 ITC TEM详细揭示 J. Colloid Interface Sci. 2018, 514, 407)。


    (4) 杂多酸与HPV衣壳蛋白的共组装

    近期,通过共组装(co-assembly)和后组装(post-assembly)两种组装方式我们分别成功地构建了HPV衣壳蛋白L1与含铕多金属氧簇(EuW10)的新型杂合组装体系。它不但有效地促进了EuW10的抗菌活性,尤其是大幅度地提高了VLPs的稳定性:4 °C条件下,将空壳VLPs的保存时间由3天分别提高到1825天。因此,这一研究对提升蛋白质疫苗的稳定性、降低其储运成本均具有重要意义;同时还将对拓展POMs药物的发展提供重要理论依据 (ACS Appl. Mater. Inter. 2018, 10, 6137)

                     

    III. 骨疾病相关蛋白酶检测及靶向性药物研发:

    组织蛋白酶K (Cath K)是参与骨代谢的主要酶,除了具备降解溶酶体蛋白质的主要功能外,还被认为与人体肿瘤、骨质疏松症、骨关节炎等多种重要疾病密切相关,是近年来备受关注的一类药物靶标蛋白酶。它既在骨吸收过程中参与骨基质降解,又与骨形成过程中的骨矿化密切相关。我们以肼腈类Cath K抑制剂为调控探针,利用多种化学和生物学技术相结合方法,开展了如下研究:

            (1) 具有不同P3位结构的肼腈类组织蛋白酶抑制剂及应用:

      我们设计合成了一系列具有不同P3位基团的新型、高效肼腈类抑制剂,研究了它们对四种组织蛋白酶(KBLS)的抑制效应及选择性。其中的15个拟肽肼腈类抑制剂均能高效地抑制Cat KL的活性,对它们的抑制常数均在亚纳摩尔浓度级或更低(10-10 ~10-12 M);而对Cat BS的抑制常数也均在纳摩尔浓度级(10E-9 M)或更低。通过进一步的结构优化和筛选,P3位是间位三联苯的化合物13Cat K的抑制效应可达皮摩尔浓度级 (Ki= 3.1 pM), 是系列I中抑制效应最强的化合物;且它对Cat KB/S的选择性在1000倍左右。(Org. Biomol. Chem. 2013, 11, 1143 ; 授权专利I201210179098.2

    (2) 肼腈类组织蛋白酶K 抑制剂及其在治疗骨质疏松症方面的应用:

    进一步,为提高抑制剂对高同源酶Cat KL的抑制选择性,我们设计合成了系列ІІ抑制剂。与系列I相比,这类新型的抑制剂中P2-P3连接部位被缩短、且具有不同的P3位基团;其中化合物13¢对结构十分相似的高同源酶Cat KL的选择性被提高到320倍,同时对组织蛋白酶KB/S的抑制选择性分别被提高到8566/1784, 极大地提高了其作为药物开发的可能性,使其在临床上对于骨质疏松症及相关疾病的治疗具有更强的潜在应用前景。此外,利用共价对接模型研究了抑制剂对不同酶抑制效应的差别,详细展示了相应的结合模式和分子机理,为进一步设计高选择性抑制剂奠定基础。(Org. Biomol. Chem.2013, 11, 5847授权专利II:201310021388.9)

    (3) 拟肽肼腈类组织蛋白酶K抑制剂对骨矿化及骨吸收的调控研究:

    选择了三种细胞—人成骨肉瘤细胞(Human osteosarcoma Saos-2 cells)、小鼠单核巨噬细胞白血病细胞 (RAW264.7)及小鼠骨髓破骨细胞(Primary osteoclasts),作为检测CKI细胞毒性的研究模型。利用MTT测定方法考察了抑制剂对细胞存活率的影响,在获得细胞毒性相关数据的同时,还为接下来的实验研究寻找到了最佳的测试浓度。在对细胞持续给药培养3天后,测得MTT实验结果表明:随着浓度逐渐升高(0.1 -1000 nM)CKI-8CKI-13Saos-2细胞及RAW 264.7细胞的存活率没有影响,在高浓度下也不具有细胞毒性;然而,破骨细胞测试结果显示:在1000 nM浓度下,CKI-8CKI-13分别抑制了破骨细胞存活的40%60%;而作为对照组的、商业化的组织蛋白酶抑制剂E-64,其在0.1 -1000 nM浓度范围内对所测试细胞均没有显示毒性。另外,测试结果表明,测试时介质中0.1% DMSO的存在下并不影响细胞的存活率 (PLoS One. 2015,10, e0120087;Plos One, 2015, 10, e0132513.)

    我们又利用人成骨肉瘤细胞(Human osteosarcoma Saos-2 cells)与小鼠颅骨成骨细胞(Calvaria primary osteoblasts)作为模拟骨骼矿化的细胞模型,检测了CKI-8CKI-13对骨矿化效应的影响。在成骨因子(抗坏血酸与β-甘油磷酸)的刺激诱导下,Saos-2 细胞与小鼠成骨细胞在细胞内逐渐形成钙结节(钙-磷复合物)。通过茜素红染色,在光学显微镜下能够清晰地观察到钙结节的产生。结果显示:未加入成骨因子的细胞中其矿化能力要明显弱于加入成骨因子的细胞内的钙结节程度。